近日，广州医科大学第一附属医院的顾卫丽团队在《Annals of Translational Medicine》杂志发表了一篇题为“Metabolic signatures of lymphangioleio-myomatosis in biofluids: nuclear magnetic resonance (NMR)-based metabonomics of blood plasma: a case-control study”的文章，文章基于核磁共振波谱技术（NMR），探讨和比较淋巴管平滑肌瘤病（LAM）患者与健康对照组之间血液代谢物的特征和差异，以寻找可用于LAM诊断和分类的生物标志物。核磁共振作为一种新的无创诊断方法，该研究为LAM患者找到潜在标志物做出了有益贡献。天津市临床多组学重点实验室，其依托单位谱天生物与布鲁克在核磁共振波谱技术中国推广达成长期战略合作。基于核磁共振波谱技术的微量样本无损检测、高通量全程自动化、无与伦比的重现性，独家数据库平台等优势，与广州医科大学合作共同完成该项目，在该项目中负责样本核磁共振检测和数据分析部分，并列为文章共同作者。

研究背景

淋巴管平滑肌瘤病（LAM）是一种罕见的、低级别的恶性肿瘤，几乎仅影响女性。有两种类型：无遗传背景的散发性LAM（S-LAM）和与遗传性疾病结节性硬化症相关的LAM（TSC-LAM）的平均发病率约为4.9/1百万，TSC在人群中的发病率为≈1/20000，80%的40岁女性TSC患者出现肺部囊性改变，常见的症状包括呼吸困难、咳嗽、乳糜积液或气胸，随着疾病的进展，肺功能恶化。TSC-LAM还具有TSC的其他多系统临床特征，包括对神经系统和皮肤的影响。目前，肺或肺外病理诊断是诊断LAM的金标准，但获取病理标本对患者来说是创伤性的，并有发生气胸、出血等不良反应的风险。

血清VEGF-D水平可作为区分LAM与其他肺部疾病的非侵入性生物标志物，然而VEGF-D的局限性是，它仅在严重淋巴管受累的患者中增加，且仍有许多LAM患者的VEGF-D没有增加。因此，有必要寻找新的生物标志物，以进一步提高LAM的诊断效果，并有希望区分疾病类型。

核磁共振(NMR)波谱是一种先进的测量方法，可以提供大量的代谢组学数据，包括脂质指标、代谢物和氨基酸。在脂质方面，核磁共振不仅可以根据脂蛋白颗粒大小对不同的脂蛋白进行分组(极低密度脂蛋白(VLDL-1~5)，中密度脂蛋白(IDL)，低密度脂蛋白(LDL-1~6)，高密度脂蛋白(HDL-1~4))，还可以根据物质在磁场中的不同反应，定量测定脂蛋白(胆固醇酯(CE)、游离胆固醇(FC)、甘油三酯(TG)和磷脂(PL))的含量。在本研究中，我们结合核磁共振波谱和实验室检测，比较LAM患者和健康受试者之间以及不同类型的LAM患者之间的血浆脂蛋白和代谢物，寻找差异差异，为LAM的无创诊断和分类提供参考。

研究方法

1. 人群

从2020年1月到2022年1月，连续纳入了广州医科大学第一附属医院门诊的69例LAM患者。所有受试者均符合美国胸科学会/日本呼吸学会的标准。诊断主要基于临床病史、肺高分辨率计算机断层扫描（CT）（弥漫性薄壁囊性病变）和病理(LAM细胞）的表现。排除标准为：(I)含有其他类型的恶性肿瘤；（II）含有风湿病、内分泌疾病；（III）资料不完整。69例LAM患者中，2例因其他共病被排除（1例乳腺癌，1例甲状腺机能亢进），67例患者进入下一期研究，其中4例因资料不完整被排除，2例患者拒绝采血。最后，共计61例LAM患者。

2. 分组

51例散发性LAM（S-LAM）、10例结节性硬化症LAM（TSC-LAM）和30名健康对照组。

3. 样本收集及运输

所有受试者禁食10小时后，将静脉血样本抽取到真空管中，室温保存30 min，离心（1200×g，10 min）。血浆样品在真空管中收集，−80℃干冰运输。

4. 统计分析

数据采用谱天Umbrella程序进行分析。两组间数据比较采用Wilcoxon检验、独立样本t检验或χ2检验。以P值（<0.05）和Foldchange（FC）（<0.83或>1.2）为筛选标准，寻找差异指标，采用逻辑回归建模。

研究思路

在S-LAM、TSC-LAM、健康人中，采用Wilcoxon检验、独立样本t检验或χ2检验、Logistic建模相关分析，确定差异指标，为LAM的无创诊断和分类提供参考。

研究结果

1. 基本的人口统计学信息和临床特征

根据美国胸科学会/日本呼吸学会的临床实践指南，61例稳定的女性患者符合标准（51例S-LAM，10例TSC-LAM）。所有患者在入组前都完成了肺部的CT扫描。肺CT显示双侧肺囊肿呈弥漫性分布，符合LAM的特征。诊断后1个月内采集患者采血，抽血时未接受任何治疗。患者的年龄、肺功能指标均为正态分布数据，以平均±标准差表示。S-LAM组与TSC-LAM组间的多数临床指标均无显著性差异。所有LAM患者和对照组均为亚洲人，其平均年龄为40.70±8.59年（S-LAM患者为40.90±8.68年；TSC-LAM患者为39.70±8.49年）。均无吸烟史，3例（4.92%）有LAM或TSC家族史。61例患者中，44例（72.13%）接受了活检，28例（45.90%）为气胸，5例（8.20%）为乳糜胸，39例（63.93%）有肺受累。在受累的肺外器官中，肾性AML所占比例最大（23例，37.70%），其次是肝脏、腹膜后AML、子宫肌瘤和乳糜性腹水。TSC-LAM组肺受累率明显高于S-LAM组，尤其是肾脏组。作者还在基线时测试了肺功能。肺通气功能指标包括第一秒用力呼气量（FEV1）预测%（70.26%±27.50%）、用力肺活量（FVC）预测%（90.63%±16.03%）和FEV1/FVC%（66.93%±23.54%）。一氧化碳肺扩散能力单呼吸%（DLCO-SB%）预测为57.28%±21.63%。

2.LAM患者与健康对照组之间的差异指标

LAM患者与健康对照组之间有15种不同的脂蛋白指标，主要是低密度脂蛋白（LDL）的第五和第六成分，有18种差异代谢产物（均P<0.05和FC >1.2或<0.83，表2）。

3.S-LAM患者与健康对照组之间的差异指标

有10种不同的脂蛋白指标，主要是LDL的第六种成分，有18种差异代谢产物（均P<0.05和FC >1.2或<0.83，表2）。

4.TSC-LAM患者与健康对照组之间的差异指标

有14种不同的脂蛋白指标，主要是LDL的第六成分，有8种不同的代谢物（均为P<0.05和FC >1.2或<0.83，表2）。

5.S-LAM与TSC-LAM之间的差异指标

S-LAM与TSC-LAM之间有显著差异的代谢物为肌酐和丙酮（均P<为0.05和FC>为1.2或<为0.83，表2）。两组间脂蛋白差异无显著性差异。

6. 选择LAM患者与健康对照差异的指标进行逻辑回归分析

将LAM患者与健康对照组比较得到的15个差异脂蛋白指数和18个差异代谢物采用logistic建模。在验证队列中，中位数模型的AUC值为0.9737，模型的敏感性和特异性分别为100%和89%。在本组所有受试者中，分别绘制ROC曲线，作为中位数模型中出现的高频指标或指标，以区分患者和健康人。其中，诊断效果较高的指标为蛋氨酸（AUC =0.929，敏感性=73.8%，特异性=100%，临界值=0.011 mmol/L）和乙酸（AUC =0.966，敏感性=95.1%，特异性=90%，临界值=0.006 mmol/L）。

7. 选择S-LAM患者与健康对照组之间差异显著的指标进行逻辑回归分析

将S-LAM患者与健康人的10个差异脂蛋白指标和18个差异代谢物进行逻辑回归建模。在验证队列中，中位数模型的AUC值为0.9852，模型的敏感性和特异性分别为100%和93%。在本组所有受试者中，分别绘制ROC曲线，作为中位数模型中出现的高频指标或指标，以区分患者与健康人群。其中，诊断效果较高的指标为蛋氨酸(AUC =0.924，敏感性=值72.5%，特异性=值100%，临界值=值0.011 mmol/L)和醋酸（AUC=值0.963，敏感性=值94.1%，特异性=值90%，临界值=值0.006 mmol/L）。

8. 选择TSC-LAM患者与健康对照组之间有显著性差异的指标进行逻辑回归分析

将TSC-LAM患者与健康对照组比较得到的14个差异脂蛋白指数和8个差异代谢物，采用逻辑回归建模。在验证队列中，中位数模型的AUC值为1，模型的敏感性和特异性分别为100%和100%。在本组所有受试者中，分别绘制ROC曲线，作为中位数模型中出现的高频指标或指标，以区分患者和健康人。其中，诊断效果较高的指标为蛋氨酸（AUC =0.948，敏感性=80%，特异性=100%，临界值=0.011 mmol/L）、乙酸（AUC =0.975，敏感性=100%，特异性=90%，临界值=0.007 mmol/L）和肌酐(AUC =0.917，敏感性=80%，特异性=95%，临界值=0.059 mmol/L）。

9. 差异代谢物与临床指标的相关性分析

收集61例LAM患者的临床指标，包括年龄、肺功能（FEV1%、FVC%、FEV1/FVC、DLCO-SB%）、气胸、乳糜胸、肾AML、肝病变、乳糜腹水、子宫肌瘤和腹膜后AML。分析临床指标与诊断效率高的差异指标（丙氨酸、蛋氨酸、L6TG、醋酸、L6PL、肌酐、组氨酸、2-氨基丁酸、丙酮、肌氨酸）的相关性。蛋氨酸与气胸的发生显著相关（P<0.05），肌酐与子宫肌瘤显著相关（P<0.05）（图5）

讨论

这是首次使用核磁共振方法对亚洲人群中的LAM患者进行代谢组学分析。本研究是为了寻找LAM的血液生物标志物，并评估这种无创检查的有效性。研究发现，与健康对照组相比，S-LAM和TSC-LAM患者共同显示部分LDL第六成分表达上调。作者还发现了一些氨基酸的代谢异常，如蛋氨酸和丙氨酸下调，乙酸和肌酐上调。这些指标是高频指标或中位数模型中同时出现的三种模型中的指标。此外，研究人员还发现，S-LAM和TSC-LAM亚组之间的肌酐和丙酮存在显著差异。蛋氨酸水平在LAM患者中显著低于健康人。蛋氨酸是维持细胞生长和蛋白质翻译所必需的氨基酸。在许多肿瘤中都观察到蛋氨酸代谢异常（下调），如神经胶质瘤和肺癌。在LAM患者和两种LAM亚型（S-LAM和TSC-LAM）中，蛋氨酸显著下降，这表明肺囊性变性可能与蛋氨酸的下调有关。且蛋氨酸可以有效地区分LAM与健康人群，AUC值为0.929，临界值为0.011 mmol/L。蛋氨酸与气胸的发生显著相关，提示患者血液中蛋氨酸水平较低，可能是早期预测气胸风险的一个指标。在未来，还需要深入的研究来证实这种可能性。另一个诊断效果较高的指标是乙酸。与健康对照组相比，LAM患者的其表达显著上调。AUC值为0.966（敏感性=95.1%，特异性=90%），临界值为0.006 mmol/L。先前的一项研究发现，在他们对乳腺癌患者进行的代谢组学分析中，与健康对照组相比，乙酸水平升高，使其成为一种潜在的生物标志物。乙酸在肺癌和肝癌中显著升高，这证实了乙酸及其代谢物可能有促进肿瘤生长的作用。

此外，作者还发现丙氨酸有差异表达。与健康对照组相比，癌症患者血浆中的丙氨酸水平显著降低，这很可能是由于作为主要的糖异生前体，以满足肿瘤细胞的高糖摄取和需求。胰腺癌细胞依赖细胞外丙氨酸作为碳源，以谷氨酸-丙酮转氨酶2（GPT2）依赖的方式促进三羧酸循环。最近的一项研究重新确定了丙氨酸在T细胞激活中的作用。GPT2负责丙氨酸分解代谢，将丙氨酸转化为丙酮酸，丙酮酸是线粒体代谢的主要底物。丙酮酸可以通过补充三羧酸循环来补偿谷氨酰胺的消耗，并通过利用不同的酶（如丙酮酸脱氢酶复合物或丙酮酸羧化酶）的活性来维持癌症的合成代谢过程。在本研究中，丙酮在S-LAM患者中明显高于健康对照组，并能够区分S-LAM和TSC-LAM。先前的一项研究发现，肺癌细胞产生的丙酮含量更高，小细胞肺癌患者血液中的丙酮含量显著升高。酮体主要负责向细胞传递能量，并参与调节各种细胞过程。癌细胞中生酮作用的增加可能是由于脂肪生成、糖异生和胆固醇生成的改变，所有这些机制都与酮体调节密切相关，或由于两者之间对初级能量化合物的高度竞争癌变和健康的细胞。本研究还发现肌酐上调。48-80%的TSC患者患有肾脏疾病，并伴有AML、囊肿、癌症和/或进展为肾功能不全。

本研究中，TSC-LAM组的AML受累率高达90%，与肌酐升高的结果一致。先前的研究显示，34-80%的TSC-LAM患者，伴有AMLs、皮质囊肿、恶性病变和/或慢性肾功能不全。与健康对照组相比，肌酐明显高于TSC-TSC患者，这反映了TSC-LAM患者肾脏受累的可能性。此外，该指标在S-LAM和TSC-LAM之间存在差异表达，显示出有望作为区分这两种亚型的指标。作者分析了LAM患者的血浆血脂代谢谱，并与健康对照组进行比较，S-LAM患者的血浆LDL-6甘油三酯显著升高，而TSC-LAM患者的LDL-6磷脂显著升高。先前的研究表明，乳腺癌与脂质紊乱相关，血液中低密度脂蛋白水平的升高可能与肿瘤脂质重编程代谢有关，与本研究结果一致。利用核磁共振平台对升高的脂蛋白亚组进行了分类，发现LDL的第六成分升高，这在常规临床脂质检测中通常被忽略。许多研究发现，低密度脂蛋白可促进乳腺癌细胞的增殖、转移和血管生成。这些代谢物及其在细胞存活和信号转导中的潜在生物学作用之间的关联表明，脂质可能既是疾病相关的生物标志物，也是LAM的潜在治疗靶点。综上所述，实验数据与之前对其他类型肿瘤的报道一致，表明LAM中LDL显著升高但LDL-6甘油三酯和LDL-6磷脂的AUC不高。脂蛋白异常与LAM发生之间的确切机制尚不清楚，有待于未来更多的基础研究进一步探索。

由于LAM是一种罕见的疾病，本研究纳入的研究对象数量有限，特别是TSC-LAM是一种罕见的罕见疾病，因此病例数量非常少。作者希望在未来能够扩大患者的数量和多中心的研究来克服这一限制。此外，虽然LAM患者和健康对照组之间的一些脂蛋白和代谢物存在显著差异，但其潜在机制尚不清楚。未来，对动物模型或细胞模型的研究可以进一步证实其代谢途径等相关机制，并在治疗药物方面取得突破。

小结

在本研究中，首次通过核磁共振技术深入探讨了LAM患者的血液代谢特征。核磁共振对血液样本具有良好的鉴别能力，从而为LAM的无创诊断方法开辟了新的可能性。代谢紊乱是LAM的表现之一。LAM患者血浆中的蛋氨酸和乙酸水平可作为疾病诊断的生物标志物。蛋氨酸也被发现与LAM患者的气胸相关。丙酮和肌酐是区分S-LAM和TSC-LAM的很有前途的代谢标志物。