近日，中国医学科学院、北京协和医学院肿瘤医院、分子肿瘤学国家重点实验室研究员赵晓航团队，联合中国医学科学院基础医学研究所孙伟团队发表题为“Noninvasive urinary protein signatures associated with colorectal cancer diagnosis and metastasis”的研究成果于国际知名期刊Nature Communications (IF=14.919)，研究对993例具有明显转移风险的结直肠癌患者组织样本和657例尿液样本进行了discovery-verification-validation 研究，全面识别和验证尿液中更准确的无创生物标志物。
研究背景结直肠癌(CRC)是全球第三大常见的恶性肿瘤，也是癌症死亡的第二大原因，值得注意的是，CRC诊断时的临床分期，主要由区域淋巴结转移（LNM）和远处转移（DM）定义，是与CRC患者生存和复发最直接相关的预后因素。在临床中，影像学和血清癌胚抗原(CEA)检测在监测结直肠癌的复发和转移中起着核心作用。然而这些主流成像方式存在一些缺陷，包括成本高、对小淋巴结或病变（<1 cm）的检测差，并且不适合植入物或肾功能受损的患者。因此，目前的单一监测策略不足以评估转移和复发，临床上仍然迫切需要更准确和无创的生物标志物。 尿液可以快速反映身体的变化，是发现早期和敏感的生物标志物的一个来源，此外其蛋白质组成明显低于血清或血浆。因此尿液是生物标志物分析的良好样本。之前的研究在人类尿液中发现了>8000蛋白，大约40%的尿蛋白来源于血浆蛋白，在健康个体的尿液中可以检测到超过1800种在结肠中高表达的蛋白。因此识别尿液中结直肠癌的非侵入性生物标志物是可行的。 研究思路队列选择：lCRC NM：没有任何转移的CRC患者；lCRC LNM：有LNM转移的CRC患者；lCRC DM：有远处转移的CRC患者。 lHealthy control：健康人 工作流程：如一系列基于MS和免疫测定的方法，包括TMT标记量蛋白质组学策略、基于PRM的靶向蛋白质组学方法、定量点阵分析和组织免疫组织化学方法（图1）。
图1 研究样本纳入和排除标准的总体工作流程，以及CRC尿液生物标志物的发现、PRM验证、免疫分析验证和组织验证 研究结果发现队列的差异蛋白质组学分析 利用TMT方法在四组样本中分别定量了1976、2151、2634和2771个蛋白，对四组中995种常见蛋白进行PCA分析，结果显示HC组和CRC组之间有明显的区别。NM、LNM或DM和HC之间的成对差异尿蛋白分析共鉴定出273、337和355个蛋白。这些差异蛋白在肿瘤相关通路中富集，包括肿瘤生长、肿瘤侵袭、免疫反应、代谢和信号通路（RAC、FAK、CDC42和RhoA）（图2b）。
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基于PRM的靶向验证
研究采用了一种广泛使用的靶向高通量蛋白质组学技术PRM，来定量验证差异尿蛋白。在发现的CRC及CRC转移相关差异蛋白中，分别选择了112个和54个随着CRC进展呈梯度增加或减少趋势的蛋白进行PRM验证。其中，在PRM方法设计中鉴定出77个蛋白，之后在82个独立样本中进行分析（图1）。最终41个差异蛋白中的66个多肽段被成功验证，其趋势与四组中的TMT方法一致。基于其中23个上调蛋白，采用多水平分析来确定结直肠癌的尿蛋白特征，通过斯皮尔曼相关性对其进行评估，排除9个与其他5个以上蛋白中等相关的蛋白(rho≥0.6)，选择其余14个相互依赖性较小的蛋白（中位数相关系数为0.34）进行后续分析。
之后研究采用这14个蛋白质使用随机森林算法确定了诊断模型和转移模型中最重要的特征。同时使用ROC分析了各蛋白在诊断和转移风险分层中的分类性能。选择两种模型中最高值前10位的蛋白质作为候选分类器。8种常见蛋白在CRC诊断或转移风险分层方面表现良好。此外通过比较诊断和转移风险分层的联合AUC值来评估任何两种蛋白的互补性能。最后，用于CRC诊断的尿蛋白特征包括CORO1C、ARPC5和RAD23B，CRC转移的分类器包括CORO1C、RAD23B、GSPT2和NDN。
尿蛋白标志物的免疫分析验证
为了在大规模上验证尿液特征以大规模区分HC和CRC患者，研究根据之前使用血清检测方法，开发了一种使用尿液的定量点印迹检测系统。用各蛋白的标准曲线定量尿蛋白量，然后用相应的尿肌酐测量值进行校准。在免疫分析验证阶段，本研究共招募了434份尿液样本，结果显示CRC患者尿液中CORO1C、ARPC5、RAD23B、GSPT2和NDN的浓度显著高于HC患者。并且，对122个样本（训练集：HC，n=51；CRC，n=33；验证集：HC，n=22；CRC，n=16）进行了CRC筛选生物标记物拟合的测量，结果显示与单独使用CEA相比，尿蛋白标记与血清CEA的结合具有更好的预测能力。
组织蛋白质反映了CRC晚期和不良预后
为了评估尿液中三种诊断相关蛋白的异常改变是否源于大肠癌组织，本研究在多个组织芯片中进行了免疫组织化学染色分析。CORO1C 和 ARPC5定位于细胞质，而RAD23B主要定位于细胞质和细胞核。在邻近的非癌组织中，CORO1C、RAD23B和ARPC5染色相对较弱。相反，在大肠癌肿瘤组织中，分别观察到CORO1C、RAD23B和ARPC5的阳性免疫染色，与相邻的非癌组织相比，显示出显著的上调（均P<0.0001）。
随后的Kaplan–Meier生存分析表明，高CORO1C蛋白水平的CRC患者无复发生存（RFS）时间更短（P=0.0075），但总体生存时间更短（P=0.9171）。在CRC患者中，RAD23B与不良总体生存率显著相关（P=0.0124），但与RFS（P=0.1123）无关。然而，ARPC5在大肠癌中没有预后意义。综上所述，由于这两种尿蛋白在诊断和转移特征上是共同的，高水平的CORO1C和RAD23B组织表达确实促进了大肠癌中恶性细胞的转移潜能。
在这项研究中，结合定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学和免疫分析，系统地分析了用于CRC诊断和预后预测的尿蛋白。迄今为止，这是确定大肠癌非侵入性生物标志物的最大和最全面的研究。结果也表明，尿蛋白组能全面反映大肠癌不同阶段，甚至早期的病理生理变化。
本研究结果为可靠地诊断和检测大肠癌提供了有希望的尿蛋白生物标记物，无论是否与FIT试验相结合，但也表明了转移性大肠癌的潜在干预靶点。由于只有少数早期CRC患者入选，因此检测I期CRC的诊断模型的准确性需要进一步验证。此外，还需要使用更大的队列（尤其是来自多中心的队列）进行外部验证，以推广结论。此外，这些生物标志物在大肠癌进展过程中的潜在机制尚不清楚，将是未来的研究探索的方向。
