近日，美国东弗吉尼亚医学院癌症研究中心Lifang Yang团队提出了一种优化的结合了THP聚合物还原和碱性洗涤的差速超速离心方法，以改善EV的分离，并去除THP和其他常见的蛋白质污染物。

在应用于尿液中表达的前列腺分泌物时，实现了已知前列腺癌和前列腺癌相关EV蛋白的相对富集。该方法为尿液细胞外囊泡的蛋白质组学分析提供了一个非常有潜力的策略。

研究背景

对来自患者样本的细胞外囊泡（EVs）的分离提取和随后的分子分析，是了解囊泡生物学并促进生物标志物的开发而广泛使用的策略。尿液中表达的前列腺分泌物是一种肿瘤近端液体，作为潜在的前列腺癌（PCa）生物标志物的来源，在液体活检中得到了极大的关注。对来自PCa患者尿液的前列腺分泌物（EPS-urine）的尿液细胞外囊泡（uEV）的蛋白质分析有望开发非侵入性PCa生物标志物，以改善该疾病的临床管理。然而从尿液中分离EV存在固有的重大挑战，标准的EV分离方法，如差速超速离心法（dUC），回收率较低，并且随EV共同分离得到的蛋白质污染物在典型的质谱（MS）检测中降低了低丰度uEV蛋白的检测深度。因此，研究团队开发了一种改进的dUC方法，使用碱性洗涤方式有效提高回收率，降低蛋白污染物，并将该方法应用于前列腺癌患者尿液样本分析，探讨了前列腺癌相关尿液细胞外囊泡蛋白组学的应用。

研究结果

先前的研究表明，还原剂可以有效地解聚低速沉淀中的THP基质（Tamm-Horsfall蛋白（THP）），以释放THP包被的EV；然而，THP低聚物/单体和其他丰富的蛋白质可以在随后的高速超速离心（UC）中与EV共沉淀，绕过THP解聚步骤可以避免这些污染物，但随之而来的是部分尿液EV的损失。碳酸钠洗涤剂可以用于分离整体膜蛋白和外周膜蛋白。因此，该研究人员推断，引入碱性碳酸钠洗涤可以通过改变EV及其结合蛋白的可离子化基团的质子化状态来提高EV的纯度，从而减少非共价相互作用。通过比较四种uEV分离方法评估了碱性洗涤步骤的有效性：（1）低速沉淀（20,000g）的DTT处理和高速沉淀的碱性洗涤（175,000g）;（2）低速沉淀的DTT处理和高速沉淀的PBS洗涤;（3）绕过低速沉淀的DTT处理，对高速沉淀采用碱性洗涤;（4）绕过低速沉淀的DTT处理，并采用PBS清洗高速沉淀。这四种方法分别称为 DTT-ALK、DTT-PBS、ALK 和 PBS。

dUC方法的原理图

多种优化的差速超速离心策略分离uEV的比较

与其他方法相比，DTT-ALK制备的uEV中的THP污染显著降低，使 CD9/THP 比率提高了 37–42 倍，TSG101/THP 比率提高了 29–92 倍。所有方法得到的uEV都含有具有特征的圆形囊泡结构。重要的是，在碱性条件下分离的uEV（DTT-ALK和ALK）显示出完整的膜包封囊泡，表明碱性洗涤不会干扰uEV的结构完整性。

dUC富集的eps -尿细胞外囊泡的特征

所有方法都富集了粒径分布在50和150nm之间的小颗粒，这些颗粒大小在小型EV的预期尺寸范围内；DTT-ALK和PBS方法分离的颗粒的均值和mode尺寸没有显著差异，与DTT-PBS相比，DTT-ALK和PBS的平均和mode颗粒尺寸显著降低；DTT-PBS方法的总体平均颗粒含量最低，DTT-PBS的平均蛋白质/颗粒比（2.46±0.80 SD）明显高于其他方法（DTT-ALK 1.16±0.14 SD; PBS 1.00±0.15 SD），表明这种方法所分离的uEV的纯度最低。总的来说，这些发现表明，DTT-ALK方法具有最佳的uEV分离效率和结构完整性，并且减少了尿液THP污染物。

从eps尿液中分离的EV纳米颗粒富集跟踪分析 

uEV的蛋白质组学分析

为了揭示uEV的蛋白质组成，研究者通过DTT-ALK，DTT-PBS和PBS方法分离的uEV进行了深入的蛋白质组学分析。对uEV P4级分进行无标记的LC-MS/MS定量。在基于DTT-ALK方法的uEV中，鉴定的蛋白质的平均数量最多（1786±9.8 SD），其次是PBS（1598±19.7 SD）和DTT-PBS（1275±2.9 SD）方法。主成分分析表明，由DTT-ALK方法分离的EV更类似于PBS（而不是DTT-PBS）。这些结果强调了每种uEV分离方法的差异蛋白质含量，并表明通过DTT-ALK和PBS分离的uEV表现出相对更大的相似度。

不同EV分离方法的LC-MS/MS鉴定蛋白组的比较

前列腺癌相关蛋白和组织特异性蛋白的相对富集情况

研究人员对比分析了前列腺特异性和前列腺癌相关生物标志物在不同方法之间的相对富集程度，并收集了一份27个PCa生物标志物蛋白的清单，这些蛋白在该研究的数据集中存在，并从文献中证实存在于uEVs中。此外，对照TiGER（组织特异性基因表达和调控）数据库搜索该研究的数据集，寻找 "在前列腺中优先表达 "的基因转录组，由此产生的列表包括33个推定的PCa生物标志物。

结果表明， 27/33个蛋白质的平均强度在三种方法中存在明显差异。分泌蛋白包括前列腺酸性磷酸盐（ACPP/PAP）、激肽释放酶2（KLK2）和前列腺特异性抗原（KLK3 / PSA），在DTT-ALK分离的uEVs中减少，在DTT-PBS方法中富集。相反，DTT-ALK方法显著富集了包括金属还原酶2/4（STEAP2/4）、无糖胺7（ANO7）、谷氨酸羧基肽酶2（FOLH1/PSMA）、视黄醇脱氢酶11（RDH11）、二肽基肽酶4（DPP4）和细胞内蛋白如肽基脯氨酰顺反异构酶FKBP5（FKBP5）、脂肪酸合成酶（FASN）、山梨糖醇脱氢酶（SORD）、蛋白NDRG1（NDRG1）、copine-4（CPNE4）等细胞内蛋白生物标志物。这些结果再一次表明DTT-ALK方法可以富集来自前列腺的uEV。

通过独创性通路分析（IPA）来鉴定所有三种方法分离得到的uEV中的PCa相关信号通路，结果表明，使用DTT-ALK方法分离的uEV可以富集前列腺来源和PCa相关蛋白。

结论

该项研究开发了一种有效的EV分离方法，将DTT处理和碱性洗涤整合到dUC中，以分离出更高纯度、更高产量的uEV。该方法代表了一种易于使用且高效的dUC策略，耗尽大量的尿蛋白以及通过非共价结合作用结合在uEV的蛋白冠，进而提取得到uEV。这样的制备方法可以通过LC-MS/MS对前列腺源性uEV进行全面的深度的蛋白质组学分析。此外，DTT处理和碱性洗涤可以在其他的uEV分离工作流程中应用，进一步提高uEV的纯度。这一方法可以改善尿液临床样本的后续生物标志物发现和开发。

参考文献

Correll V L, Otto J J, Risi C M, et al. Optimization of small extracellular vesicle isolation from expressed prostatic secretions in urine for in‐depth proteomic analysis[J]. Journal of extracellular vesicles, 2022, 11(2): e12184.