蛋白质的定位和相互作用往往是其生物学功能的基础，对于理解蛋白质在细胞和组织中的功能至关重要。空间蛋白质组学技术允许在保持细胞和组织的空间结构完整性的同时，对蛋白质进行高分辨率、高深度的分析，从而更好地理解细胞内的信号传导、细胞间的通讯以及细胞与细胞外基质的相互作用等生物学过程。空间蛋白质组学（spatial proteomics）被《Nature Methods》评选为2024年度技术，彰显了其在揭示生物复杂性、推进精准医学和癌症研究中的革命性作用。
2025年3月，广东智慧医学国际研究院、慧眼大设施工程贺福初院士团队、北京航空航天大学刘超课题组与中山大学孙逸仙纪念医院张洪华博士合作在Analytical Chemistry期刊上发表题为“High-Efficiency Cell-Type Proteomics Strategy Deciphers Cholangiocarcinoma Fibrosis-Associated PathologicalHeterogeneity”的文章。文章描述了一种细胞类型分辨的高效空间蛋白质组学分析技术，该技术结合病理图像分析算法π-CellSeg-CCA、激光显微切割LMD、SISPROT样品前处理技术及高灵敏质谱检测技术，并成功应用于解析胆管癌纤维化相关病理的异质性。π-CellSeg-CCA算法可以自动圈选胆管癌切片病理图像中的胆管癌和正常胆管细胞簇，识别准确率达到90%，并将细胞簇轮廓导入激光显微切割仪进行高效切割。利用该方法，研发团队从1mm2切片样本中鉴定超过8000种蛋白质，包括在胆管癌中特异性表达的标志性蛋白；并且发现了在纤维化区域胆管癌中特异性上调的标志性蛋白MUC16，揭示了其与患者不良预后和胆管癌病情进展之间的联系。
文章主要内容
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本研究建立了一种细胞类型分辨的高效空间蛋白质组学分析技术，该技术结合了病理图像分析算法π-CellSeg-CCA、LMD、SISPROT样品前处理技术及高灵敏质谱检测技术。胆管癌切片经H&E染色并扫描图像后，通过π-CellSeg-CCA算法自动圈选图像中的胆管癌和正常胆管细胞簇，并将细胞簇轮廓导入激光显微切割仪进行高效切割，切割收集的样本经SISPROT处理后，由timsTOF Pro高灵敏度质谱仪进行检测（图1）。
图1 细胞类型分辨的高效空间蛋白质组学分析技术
为了高效圈选胆管癌切片H&E染色图像中的胆管癌/正常胆管细胞簇，研发团队开发了病理图像分析算法π-CellSeg-CCA。π-CellSeg-CCA由机器学习算法Mask R-CNN和ResNet-18构成，可以对胆管癌/正常胆管细胞簇进行分割、分类，并将胆管癌/正常胆管细胞簇轮廓输入到激光显微切割仪中进行高效地切割和收集。π-CellSeg-CCA的分割功能由Mask R-CNN-DCT模型实现，Mask R-CNN-DCT基于实例分割模型Mask R-CNN，在其分割分支上添加离散余弦变换（discrete cosine transform，DCT）模块，以实现在不增加模型复杂度的前提下用矢量表示高分辨率的掩码，通过高质量的掩码提升模型对细胞簇的分割性能。如图2A所示，改进后的Mask R-CNN-DCT显示出更好的分割效果，对胆管癌细胞簇的分割准确度更高。π-CellSeg-CCA对胆管癌良恶性的分类功能则由ResNet-18模型实现，识别准确率达到90%。图2B是识别为胆管癌和正常胆管的图片示例，绝大多数被识别为胆管癌图像的置信度达到了99%。
图2 π-CellSeg-CCA对胆管癌/正常胆管细胞簇分割(A)与分类(B)的性能展示，B图中的百分数为胆管癌的可能性
采用细胞类型分辨的高效空间蛋白质组学分析技术，研发团队对胆管癌纤维化相关病理的异质性进行了探究。如图3A所示，一共分析了6个正常胆管样品（Normal BD）、5个非纤维化胆管癌样品（NF CCA）和7个纤维化区域胆管癌样品（Fibro CCA），主要得到了以下结论：
1. 从1mm2切片样品中平均鉴定出8000种蛋白，同类型样本的Pearson相关系数达到0.85以上，证明方法具有良好的稳定性和分析效果（图3B和C）。
2. 两种胆管癌组织与正常胆管组织比较分析，发现3个公认的在胆管癌组织中高表达的生物标志物：S100P、MUC1和MUC5AC，证明了方法的准确性（图3D）。
3. 纤维化区域的胆管癌与非纤维化胆管癌比较分析，发现在纤维化区域胆管癌中上调的蛋白MUC16和S100A2，进行后续的验证（图3E）。
图3 胆管癌异质性的细胞类型蛋白组学分析
针对上述发现的在纤维化区域胆管癌中上调的MUC16和S100A2蛋白，考虑到MUC16的膜蛋白定位和更广泛的报道，研究团队进一步探究了其与胆管癌发生纤维化进展之间的关系，主要得到了以下结论：
1. 多重免疫荧光染色证明，MUC16在纤维化区域胆管癌中特异性高表达，并且其表达量与纤维化程度呈正相关（图4A和B）。
2. 结合临床数据统计分析，发现MUC16高表达的患者表现出更高的T分级和更严重的淋巴结转移（LNM）和远端转移（DM）情况（图4C和D）。
图4 MUC16与胆管癌发生纤维化关联性的验证
综上，本研究开发了一种细胞类型分辨的高效空间蛋白质组学分析技术，并成功应用于解析胆管癌纤维化相关病理的异质性。本研究开发的π-CellSeg-CCA算法显著提高了空间蛋白组学分析的效率，并且具有良好的可拓展性，经过调整和训练，可以应用于其他癌种的分析，具有良好的应用前景。
