癌症的转移过程通常通过循环肿瘤细胞（CTCs）脱落进入血液中扩散而实现。循环肿瘤细胞（CTCs）是由肿瘤组织自发或受外界干扰而产生并进入外周血液循环或体液中的肿瘤细胞，大部分CTCs在进入循环系统后会发生凋亡或被机体免疫细胞吞噬，而少数逃逸的CTCs有可能发展成为肿瘤转移灶，增加恶性肿瘤患者的死亡风险。
目前，研究者通常假设CTCs是在肿瘤组织不断生长的过程中脱落，或由于某种机械损伤而脱落，而决定具有转移能力的CTCs产生的动态过程并不明确。
来自苏黎世联邦理工学院的Nicola Aceto团队围绕CTC的产生和释放过程展开深入研究，结果在乳腺癌患者和小鼠模型中都观察到了令人意想不到的现象，大多数自发的CTCs内渗事件都发生在睡眠过程中。研究者证实休息状态下的CTCs更容易发生转移，而活动状态下CTCs则缺乏转移能力。这项研究成果2022年6月22日在线发表于Nature杂志，题为The metastatic spread of breast cancer accelerates during sleep。
研究思路
研究者通过单细胞RNA测序结果分析，在乳腺癌患者和小鼠模型中，都观察到了有丝分裂基因在休息期显著上调，从而佐证了其转移能力。研究者进一步系统研究了关键的昼夜节律激素，如褪黑激素、雄激素和糖皮质激素等，都决定了CTCs生成的动力学过程，胰岛素水平也直接促进了体内肿瘤细胞的增殖，且这一过程具有明显的时间依赖性。据此可以得出结论，具有高转移倾向的CTCs并不是持续性产生的，而是集中在患者的睡眠过程中，这一成果为具有转移倾向的癌症的时间控制与治疗提供了新的理论依据。
昼夜节律与CTCs释放过程
研究者招募了30名未接受治疗或暂时停止治疗的女性进展期乳腺癌患者，其中21名患者为早期无转移病灶的乳腺癌患者，9名为IV期乳腺癌患者，并在同日的活动时间（上午10点）和休息时间（凌晨4点）收集血液样本。通过微流控技术捕获CTCs并经过免疫荧光染色后，作者发现78.3%的CTCs是在休息期采集到的，其中包括单个CTCs、CTC簇和CTC-白细胞簇等形式。
为了进一步验证这些发现的普适性，并精确描述时间发生的时间依赖性，作者采用了四种不同的乳腺癌小鼠动物模型，包括人乳腺CTCs异种移植（NSG-CDX-BR16）、人乳腺癌细胞的异种移植（NSG-LM2）、小鼠乳腺癌细胞的异种移植（NSG-4T1），以及具有免疫活性的同基因乳腺癌模型（BALB/c-4T1），并在小鼠血液样本中观察到了与乳腺癌患者数据相同的现象，即多数CTC来自于休息时间采集的样本。为进一步精确研究CTC的内渗过程，研究人员以4小时为间隔收集24小时时间周期内的血液，并发现CTC释放量具有明显的震荡模式，在开灯4小时后到12小时的时间段内达到峰值，即小鼠的休息时间。通过对比休息时间（ZT4）和活跃时间（ZT16）的CTCs释放量，发现在休息时间内多种形式的CTCs均显著提高。
研究人员通过控制光照明暗变化或给予睡眠调节关键激素褪黑素的方式干扰小鼠的昼夜节律。结果发现，与正常昼夜节律的小鼠相比，昼夜颠倒的模式下CTC数量显著减少，而褪黑素却会诱导CTC的显著增多。研究人员进一步构建了节律失常的单基因敲除小鼠模型，与野生型小鼠相比，昼夜节律失常的小鼠无法生成CTC，表明了昼夜节律时钟调节因子的破坏可以阻止CTC的内渗过程。
睡眠过程中CTCs的转移能力
研究人员进一步分析了不同昼夜节律阶段释放的CTCs，结果发现其具有极高的转移能力。研究人员分别利用GFP标记NSG-LM2模型小鼠ZT4时间点收集的CTCs，RFP标记ZT16时间点收集的CTCs，并在不同昼夜节律时间点将其混合注射到无肿瘤的小鼠尾静脉中，以衡量其转移能力。通过体内生物发光成像观察到，在休息时间内转移发生率最高，并通过免疫组化染色证实转移病灶多来源于GFP标记CTCs（即ZT4时间点收集的CTCs）。这些结果表明，休息期产生的CTCs具有更高的转移活性，且在休息期形成更高的转移倾向。研究者进一步将不同形式的CTCs（单一CTCs、CTC簇和CTC-WBC簇）单独注射到无肿瘤小鼠体内并观察其转移能力，得到与混合注射相同的结论，即休息期具有更强的转移能力，且CTC簇和CTC-WBC簇的形式比单个CTCs具有更强的转移能力。以上结果表明，休息期间CTC内渗率升高的同时，其转移能力也更强。
CTCs的时间依赖性基因表达
研究人员进一步探究了决定CTCs在休息期或活动期转移能力的分子特征，分别收集BR16和LM2小鼠ZT4和ZT16的CTCs，进行单细胞RNA测序。通过主成分分析，发现采样时间点与CTCs基因表达水平直接相关。对比ZT4和ZT16采集样本的基因表达水平，共发现121个在ZT4时间点上调、156个在ZT16时间点上调的基因。在不同形式的CTCs中特征基因的变化趋势一致，其中CTC簇和CTC-WBC簇中的统计学差异最大。通过基因数据集富集分析（GSEA），研究人员发现ZT4时期分离的CTC中上调基因主要为有丝分裂和细胞分裂通路相关，ZT16时期分离的CTC中上调基因主要为核糖体生物源和基因翻译通路相关，这些发现与真核细胞中典型的基因表达时间规律是一致的。对肿瘤增殖标志物Ki67进行染色，也可以观察到其在休息期显著上调，这与CTCs内渗量和有丝分裂相关基因表达量的变化是一致的。这种周期性波动的变化不仅出现在CTCs中，在原发肿瘤中也观察到一致现象，表明这是乳腺癌细胞在疾病进展过程中发生的普遍现象。
CTC内渗过程的调节因子
最后，研究人员探究了昼夜节律驱动CTC生成和增殖的主要调节因子。首先通过分析癌细胞中典型的生物钟基因在休息期和活动期的表达差异，结果发现在CTCs和原发肿瘤细胞中均没有检测到明显差异，但在非肿瘤组织中可以观察到节律变化。进一步分析了CTC计数的振荡变化与组织液压力、免疫细胞相互作用或溶血率等因素的关系，结果均没有观察到明显的节律性差异。研究人员进一步分析了患者和小鼠模型的RNA测序数据中63个已知的昼夜节律调节激素、生长因子的受体表达水平，其中糖皮质激素受体、雄激素受体和胰岛素受体的表达在各种形式的CTCs中均存在高表达，表明这些配体参与了时间节律性的CTC生成和增殖过程。
研究总结
过往研究已经证明了昼夜节律在肿瘤发生过程中的作用，然而前瞻性的调控转移性进展过程的动态变化仍不明确。这项研究讨论了具有转移能力的CTCs的产生过程，在乳腺癌患者和小鼠模型中，均观察到CTCs的生成过程集中发生在休息状态中，且具有更高的转移倾向。这种增强的转移能力来源于时间依赖性的增殖速度的变化，且受到昼夜节律调节激素的影响。该研究结果表明，昼夜节律时间的控制对乳腺癌的研究和治疗过程至关重要。
