编者荐语：近日，由中国医学科学院肿瘤医院赫捷院士牵头的一项1B期临床研究发表在JTO杂志，为非小细胞肺癌（NSCLC）的新辅助免疫治疗提供了新证据。天津医科大学总医院徐嵩教授分享了对最新进展的分析与思考。以下文章来源于医脉通肿瘤科 ，作者医脉通免疫检查点抑制剂改变了晚期恶性实体瘤的治疗指南，然而免疫检查点抑制剂在新辅助治疗的证据尚不充分。近日，由中国医学科学院肿瘤医院赫捷院士牵头的一项1B期临床研究发表在JTO杂志，为非小细胞肺癌（NSCLC）的新辅助免疫治疗提供了新证据。天津医科大学总医院徐嵩教授分享了对最新进展的分析与思考。► 专家说徐嵩 教授天津医科大学总医院肺部肿瘤外科 副主任医师、副教授、硕士研究生导师天津市肺癌研究所 副所长、党支部书记天津市肺癌转移与肿瘤微环境重点实验室 副主任比利时布鲁塞尔自由大学，医学博士AATS Thoracic Surgery Training Fellowship 获得者ASCO Virtual Mentoring Program获得者 •Mayo Clinic, MGH, UCM和TGH 临床访问学者天津特聘教授 青年学者天津市高校“中青年骨干创新人才”天津市卫生计生行业高层次人才“青年医学新锐”天津市创新人才推进计划 “青年科技优秀人才”天津市“131创新型人才工程”第二层次人选 •CSCO“35位35岁以下最具潜力肿瘤医生” /CSCO“35under35岁”成长之星奖天津医科大学总医院“十佳医生”2020年天津市科学技术进步奖一等奖2020年中华医学科技奖医学科学技术奖三等奖2015年度中国抗癌协会科技奖 三等奖徐嵩教授：近年来，以PD-1/PD-L1为代表的免疫检查点抑制剂在非小细胞肺癌（NSCLC）的治疗中取得了极大进展，并且逐步应用于NSCLC的新辅助治疗。信迪利单抗是我国自主研发的PD-1抑制剂，已在多个癌种中展现出了较好的疗效。在这项由赫捷院士和高树庚教授发起的研究中，NSCLC的新辅助免疫治疗取得了巨大成功。此项研究共纳入了40名IA-IIIB期的NSCLC患者，平均随访时间为37.8个月。其3年总体生存（OS）达到了88.5%，3年的无病生存（DFS）率达到了75%，总体的复发率为22.2%。进一步亚组分析显示，PD-L1表达阳性（≧1%）的患者更容易从新辅助免疫治疗中获益，其3年OS率和DFS率分别达到了95.5%和81.8%。与新辅助化疗相比，新辅助免疫治疗表现出更长的OS。此外，这项研究还探索了新辅助免疫治疗的生物标记物。研究表明，尽管统计学上未表现出显著差异，但是PD-L1表达阳性（≧1%）、高肿瘤突变负荷（TMB≧10）以及较好的病理缓解率（MPR and pCR）仍表现出更好的免疫治疗获益趋势。在目前进行的NSCLC新辅助免疫治疗临床试验中，已有多项研究表明新辅助免疫治疗的效果优于新辅助化疗。在今年的ASCO会议中，Samuel Rosner等人的研究（NCT02259621）证实了Nivolumab新辅助免疫治疗的有效性2。其3年、4年和5年生存率分别达到了85%、80%和80%；其3年、4年和5年无病生存率也达到了65%、60%和60%。Provencio M等人的研究（NADIM）表明3，免疫+化疗新辅助治疗效果明显好于新辅助化疗。其3年OS和PFS分别达到了81.9%和69%。此外，在CheckMate816研究中4，新辅助免疫+化疗组的中位EFS明显长于新辅助化疗组，分别为31.6个月和20.8个月。因此，新辅助免疫治疗（+/-化疗）在NSCLC中是可行的，并且其效果好于新辅助化疗。尽管新辅助治疗被证明是有效的，但是仍然缺乏足够可靠的生物标记物来预测疗效。Samuel Rosner等人的研究发现，MPR和PD-L1表达阳性与较长的无复发生存期有关2。在NADIM研究中，原发肿瘤获得MPR与ctDNA清除也被证实与更长的DFS相关3。CheckMate816研究也证实MPR可以改善患者的EFS4。因此，PD1/PD-L1的表达、TMB、MPR/pCR以及血液ctDNA水平可能是新辅助免疫治疗的前在生物标记物，但它们的灵敏度与特异度仍需要进一步研究。目前的临床研究主要以OS或DFS为研究终点，但在新辅助免疫治疗试验中则主要以MPR/pCR作为研究终点。而MPR/pCR已被证明可预测DFS、RFS和EFS等，但与OS的相关性有待进一步证实。在未来的临床试验中，MPR/pCR是否可以替代OS成为一个新的可靠研究终点仍然需要更多研究证实。现在仍有多项NSCLC新辅助免疫治疗临床试验仍在进行当中，OS与DFS数据仍然不够完善。因此，我们也期待更多研究来证实新辅助免疫治疗的OS获益，为肺癌患者带来更多的治疗选择。► 原文解析研究背景化疗、放疗和手术切除是NSCLC的传统治疗手段。对于II期以上患者，通常在手术切除后进行辅助放化疗以获得更好的治疗效果。尽管辅助治疗提高了生存率，但NSCLC的5年生存率仍不理想。对NSCLC患者进行新辅助免疫治疗，可激活T淋巴细胞攻击肿瘤，并尽可能延长生存时间。此外，新辅助治疗反应可指导后续的辅助治疗选择。既往研究显示，与常规治疗相比，NSCLC患者可从新辅助治疗中获益更多，然而，许多接受新辅助化疗的患者常出现不良事件，如乏力、肺炎和甲状腺功能减退，这限制了新辅助化疗的应用。因此，作为一种临床效果更好、并发症更少的新兴治疗方法，免疫治疗被视为术前治疗多种癌症（包括NSCLC）的主要治疗手段。在这项研究中，研究者对NSCLC患者进行了为期3年的随访，揭示了新辅助信迪利单抗的安全性和有效性。另外，还评估了亚组患者（或可作为预测因素：PD-L1表达、肿瘤突变负荷、主要病理反应）的疗效。研究方法信迪利单抗(200mg，静脉注射)用于IA-IIIB期NSCLC(注册号:ChiCTR-OIC-17013726)患者。治疗后的29~ 43天内进行手术。所有患者在入组时和术前都进行了PET/CT，以评估PD-1抑制剂治疗后的肿瘤代谢情况。同时，研究者对32例符合条件的患者的PD-L1的表达情况进行了探索性分析（图1）。安全性是主要终点。关键次要终点包括总生存期(OS)、无病生存期(DFS)、无事件生存期和主要病理反应。图 1 研究流程图患者临床特征2018年3月6日至2019年3月8日期间，共筛查了43例NSCLC患者，最终纳入40例患者。在40例入组患者中，32例(80%)有吸烟史，33例(82.5%)为鳞状细胞癌，8例(20%)为IA期和IB期，14例(30%)为IIA期和IIB期，10例(25%)为IIIA期，8例(20%)有IIIB期(第八版TNM分期)。32例(80%)患者评估了PD-L1表达情况，其中22例(55%)PD-L1表达阳性；37例(92.5%)患者在接受新辅助治疗(2程信迪利单抗)后接受手术治疗。其中36例R0切除（图2），1例R2切除(纵隔淋巴结侵犯)。图 2 患者临床信息复发情况共8例复发(22.2%)，其中局部复发1例，肺转移3例，脑转移3例，骨转移1例。在这8例患者中，1例(12.5%)术后1年内复发，6例(75.0%)术后2年内复发。生存时间平均随访时间为37.8个月(1.73~46.5个月)。研究者分析了两个队列患者的生存时间：R0切除患者（36例）和PD-L1表达阳性(TPS≥1%)患者（22例）。在36例R0切除的患者中，3年OS率为88.5%，3年DFS率为75.0% (图3A)。在PD-L1阳性队列中，3年OS率为95.5%，3年DFS率为81.8%(图3B)。图 3 生存分析根据PD-L1表达水平，将患者分为高、中、低PD-L1亚组(1%、10%和50%)。DFS分析显示，与PD-L1＜1%患者相比，PD-L1≥1%的患者DFS更长(HR=0.275，P=0.0325）（图4A）。但是，以10%和50%为截断值的两个亚组之间没有显著差异（图4B-C）。图 4 亚组分析安全性分别在32例和21例患者中观察到不良反应（AEs）和新辅助治疗相关的AEs (TRAEs)。2例患者术后短时间内死亡，死亡原因为严重的AE: 1例患者术后第8天死于意识障碍；1例患者术后死于免疫相关肺炎。结论基于3年的随访，本研究首次提供了PD-1抑制剂用于NSCLC患者新辅助治疗的长期、全面的生存数据，证明了新辅助信迪利单抗的有效性和可行性，特别是对于PD-L1表达阳性的患者。参考文献1. Zhang F, Guo W, Zhou B, et al. Three-Year Follow-Up of Neoadjuvant Programmed Cell Death Protein-1 Inhibitor (Sintilimab) in NSCLC. J Thorac Oncol. 2022;S1556-0864(22)00216-7. doi:10.1016/j.jtho.2022.04.0122. Samuel Rosner. et al. Neoadjuvant nivolumab in early-stage non–small cell lung cancer (NSCLC): Five-year outcomes. https://meetings.asco.org/abstracts-presentations/2089073. Mariano Provencio-Pulla. et al. Nivolumab + chemotherapy versus chemotherapy as neoadjuvant treatment for resectable stage IIIA NSCLC: Primary endpoint results of pathological complete response (pCR) from phase II NADIM II trial. https://meetings.asco.org/abstracts-presentations/2089064. Mariano Provencio-Pulla. et al. Neoadjuvant nivolumab (NIVO) + platinum-doublet chemotherapy (chemo) versus chemo for resectable (IB-IIIA) non-small cell lung cancer (NSCLC): Association of pathological regression with event-free survival (EFS) in CheckMate 816. https://meetings.asco.org/abstracts-presentations/208905

近日，来自斯坦福大学的研究团队在《Nature Biotechnology》上发表了一篇题为“Inferring gene expression from cell-free DNA fragmentation profiles”的文章，基于cfDNA测序的多基因表达水平分析建立了一种分析cfDNA片段化模式的新方法，即“Epigenetic Expression Inference from Cell-free DNA-sequencing (EPIC-seq)”技术，可同时应用于癌症早期检测、分型和伴随诊断等方面。研究背景细胞游离DNA（cfDNA）是释放到血浆中的降解的DNA片段，存在于人体的各种体液中，随组织损伤、癌症和炎症反应等发生浓度变化。正常人体的cfDNA主要通过细胞凋亡过程中产生的小而均匀的185~200 bp小片段DNA。而肿瘤坏死的组织细胞由于非正常的凋亡过程，导致产生大小不同且大于200 bp的大片段DNA。1947年，Mandel和Metais首次报道了外周血中存在cfDNA。生理情况下，血液中的cfDNA主要来源于白细胞的坏死和凋亡。在某些疾病和特殊状态下，其他细胞也会释放游离DNA入血，包括来源于肿瘤细胞的循环肿瘤DNA（ctDNA）和来源于胎儿的cfDNA等。血液中循环肿瘤DNA (ctDNA)检测为非侵入性癌症检测带来希望。染色质的片段化特征曾被用来推断细胞游离DNA (cfDNA)的基因表达谱，但目前这种片段化方法需要高浓度的肿瘤源性DNA，且分辨率有限。研究方法研究人员将启动子片段描述为一种表观基因组cfDNA特征，它可以预测单个基因的RNA表达水平，通过对目标基因启动子进行靶向测序可以推断出表观遗传表达水平。通过对201例癌症患者和87例健康成年人的共329份血液样本的分析，展示了肺癌和弥漫性大B细胞淋巴瘤的亚型分型水平的研究。另外，研究人员应用EPIC-seq技术对接受PD-(L)1免疫治疗的患者的多时间点连续采样血液样本进行研究，发现其推断的基因表达谱与患者临床表现存在密切关联。这些工作表明，EPIC-seq技术可以实现无创、高通量的肿瘤组织起源分析，在诊断、预后和治疗领域具有巨大潜力。研究结果cfDNA分子特征与基因表达水平的关联研究人员假设，受活性启动子调控的cfDNA片段与非活性启动子调控相比，存在更多的随机切割模式的可能性，从而可实现从cfDNA推断单个基因表达，反映了包括实体瘤在内的不同组织来源的各种细胞类型的分型。通过对未知来源的肿瘤患者样本的深度全基因组测序分析，发现了定位到高表达基因的cfDNA分子与低表达基因相比显示出了更多的片段长度多样性特征。研究人员进一步比对了肺癌患者和健康对照样本，确定了启动子片段熵与非小细胞肺癌（NSCLC）基因表达水平显著相关。在NSCLC中高表达的基因在肿瘤患者血液中的启动子片段熵明显升高，并且与肺癌分期有关，而低表达基因则观察不到这种趋势，表明这种cfDNA特征具有基因和组织特异性。实体肿瘤中验证cfDNA推断基因表达水平研究人员进一步验证全外显子测序是否可以进一步验证cfDNA推断表达水平的准确度。通过对11例小细胞肺癌（SCLC）患者和28例健康对照者血浆cfDNA进行超深度全外显子测序，作者发现对于原发SCLC肿瘤中高表达的肿瘤基因，肿瘤患者的血浆cfDNA启动子片段熵特征明显高于健康对照组，而在SCLC肿瘤中低表达的基因则表现出相反趋势。研究人员将这两种特征表达基因合并计算得到一个可以有效区分SCLC癌症患者和健康对照组的计算模型（AUC=0.98）。在这些特征表达基因中，研究人员进一步筛选确定了三种SCLC特征标志物基因ASCL1，ANK1和ASTN1。cfDNA片段化谱推断基因表达水平（EPIC-seq技术）测序深度的增加提高了cfDNA推断基因表达水平的准确性，因此作者开发了一种基于cfDNA的TSS侧翼区域的定向深度测序与机器学习相结合的EPIC-seq技术，可以精准预测基因表达水平。为了验证这一概念，研究人员分别将EPIC-seq技术应用于实体肿瘤的非侵入式组织学分型和血液肿瘤的分子分型中。首先，鉴定出肿瘤组织中高表达且在全血样本中相对低表达的基因，然后通过分别对比肺腺癌（LUAD）和肺鳞状细胞癌（LUSC），GCB型和ABC型弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）中的差异表达，从而减低当初肿瘤亚型特异性的基因。研究人员利用EPIC-seq流程共分析了来自288例成年人的373个血浆样本cfDNA，其中包括来自87例NSCLC患者的109个血浆样本，114例弥漫性大B细胞淋巴瘤的126个血浆样本和来自87例健康对照者的94个血浆样本。最终鉴定出LUAD中高表达的特征基因NKX2-1可有效实现肺癌组织分型，在DLBCL中高表达的MS4A1（CD20）基因可有效实现淋巴瘤的免疫表型分型。EPIC-seq用于肺癌的非侵入式检测、分型与PD-(L)1免疫治疗疗效预测研究人员通过机器学习方法对肺癌患者与健康对照样本进行模型分析，将队列随机分成训练集和验证集。其中训练集包含67例肺癌患者（7例II期，30例III期，30例IV期）和71例健康对照，验证集包含20例肺癌患者和23例健康对照，训练集和验证集中的AUC分别为0.91和0.83，展现出了良好的肺癌检测效果，且III- IV期中晚期肺癌患者的EPIC分数与II期相比有所升高。为了进一步研究EPIC-seq方法在肺癌分型方面的应用，研究人员选择了一个67例肺癌患者对例，根据组织分型分为肺腺癌组（36例）和肺鳞癌组（31例），并利用训练和交叉验证方法得到了良好的分型效果（AUC=0.90）。对于晚期NSCLC患者，PD-(L)1免疫治疗十分重要，然而其药效与毒副作用的研究仍不明确，目前缺乏有效可靠的生物标志物用于在治疗前或治疗早期精准预测患者能否从免疫治疗中获益。因此，研究人员用EPIC-seq方法分析了22例接受PD-(L)1免疫治疗的NSCLC患者治疗前和治疗开始前4周的血液样本，开发了可有效预测治疗效果的“肺动态因数”。EPIC-seq用于弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）的非侵入式检测和分子分型DLBCL是一种常见的非霍奇金淋巴瘤，具有显著的临床和生物学异质性。这种异质性在临床上可通过国际预后指数（IPI）、原发肿瘤活检的基因分型等方法获得信息，但仍然缺乏有效的低侵入式检测方法。研究人员将EPIC-seq技术应用于分析91例DLBCL患者和71例健康对照的血液cfDNA，训练出一种表现良好的区分模型（AUC=0.92），在验证集（23例DLBCL和23例健康对照）中AUC达到0.96，且EPIC分析与IPI具有显著的分级相关性。进一步分析了DLBCL患者接受治疗前后的数据，证实了EPIC-seq方法可以通过分侵入式手段检测出组织来源的DLBCL信号，并真实反映出治疗前后的临床表现。DLBCL根据细胞来源分成两种不同的分型，其中GCB型患者通常具有更好的预后效果并有可能预测其靶向治疗的敏感性。因此，研究人员对治疗前的样本进行进一步的EPIC-seq分析，得出了能够良好区分出GCB型的模型分数，与基于肿瘤组织水平的分型结果具有良好的相关性（r=0.84）。总结与展望研究人员介绍了一种利用cfDNA片段模式对基因表达进行无创推断的方法即“EPIC-seq”技术，可广泛应用于临床相关应用，包括肿瘤检测、亚型分类、疗效评估和预后分析等。为了最大限度地利用这种片段化技术，仍有必要进行进一步的细化研究。局部肿瘤患者存在相当大的分子异质性，低ctDNA水平可能会阻碍其直接用于早期癌症检测。随着使用这种方法研究更多的基因和更多的片段组特征，可以得到更强的信号进行小肿瘤沉积的非侵入性检测，从而实现更多特定的信号通路活动和组织病理研究。参考文献：Mohammad Shahrokh Esfahani, Emily G. Hamilton et al. Inferring gene expression from cell-free DNA fragmentation profiles. Nature Biotechnology, 2022, 40: 585-597.

近日，Matthias Mann团队题为“Noninvasive proteomic biomarkers for alcohol-related liver disease”的研究成果发表于国际知名医学科研Nature Medicine，研究提出了一种配对的肝-血浆蛋白质组学方法来推断分子病理生理学，并探索596名个体（137例健康人和459名ALD患者）的血浆蛋白质组学的诊断和预后能力。研究背景酒精相关性肝病(Alcohol-related liver disease, ALD)是世界范围内肝病相关死亡的主要原因，ALD进展为一系列的组织学病变，从酒精相关的脂肪肝到临床症状不显的脂肪性肝炎，逐渐发展为进行性纤维化，最终导致肝硬化。如果对早期ALD进行诊断，可以通过加强酒精康复治疗和代谢性合并症的治疗来减缓或预防疾病进展，但该疾病进展缓慢和无症状的性质使早期诊断具有挑战性，并且肝病的准确诊断需要活检，因此，迫切需要采用微创诊断策略，在高危人群中筛查患者。以质谱为基础的蛋白质组学最新进展大大扩展了其在生物医学研究中的应用范围，它能够对生物或临床样本中特异性的鉴定和定量数百到数千种蛋白质。研究思路队列选择：1. ALD患者：GALA-ALD 队列（n = 459），纳入标准为滥用酒精史>1年（女性>24 gd-1，男性>36gd-1），年龄18-75岁，并知情同意接受肝活检。2. 健康人：GALA-HP 队列（n = 137），招募了与年龄（40-75 岁）、性别和 BMI 部分匹配的健康对照。3. ALD 验证队列 ( n = 63) 由 GALA-ALD 研究结束后开始的人口筛查研究中的独立参与者组成，纳入标准是酒精滥用史 > 5 年（女性≥24 g d–1 ，男性≥36 g d–1 ）和年龄 30-75 岁。蛋白质组检测流程分析思路整合分析ALD和健康人队列肝脏和血浆中的差异蛋白质组，揭示了血浆中与肝脏一致的与疾病阶段相关的蛋白。最后通过建立一个机器学习模型来识别肝纤维化、炎症活动和脂肪变性的早期阶段，并在63例ALD患者的独立队列中，评估了已识别的蛋白标记物的诊断能力。图1肝脏疾病中的生物标志物发现的思路研究结果肝脏病变对肝脏和血浆蛋白质组的影响肝脏组织采用DIA技术共鉴定到5,515个蛋白质，差异分析共得到了717个差异unique proteins，其中纤维化与对肝脏蛋白质组的影响最大，其次是炎症，并且发现在炎症中失调的所有蛋白质有 84% 在纤维化也失调（图2b）。在与纤维化分期最相关的前20个蛋白中，有显著的肝分泌蛋白（图2d）。前20个炎症相关蛋白中大约有50%是细胞骨架蛋白，这可能表明了炎症肝脏的细胞结构变化。图2 肝脏病变引起的肝脏蛋白质组差异变化肝脏和血浆蛋白质组学的整合分析肝脏和血浆中共同定量到 420 个蛋白质（图 3a），总共有46个蛋白在肝脏和血浆蛋白质组的ANCOVA分析显示为共异常调控蛋白，这些蛋白参与了免疫和炎症反应、细胞粘附、ECM组织、蛋白酶抑制剂和细胞内酶（图3g）。它们的共同失调可能是由于免疫细胞浸润、全身炎症增加、ECM重塑和瘢痕组织形成以及组织渗漏所引起的，其中PIGR、LGALS3BP、TGFBI和C7，这些蛋白都是先前报道的有意义的肝病标记物。图3 肝-血浆蛋白质组整合分析ALD早期病理学的生物标志物组研究首先比较了 22个最先进的机器学习分类器，并确定了一个逻辑回归模型作为最终分类器，最终选择了一个9个蛋白标志物组来识别显着纤维化，6个蛋白质识别轻度炎症和12个蛋白质识别肝脂肪变性。在包含三个标志物组的22个蛋白质中，有8个在血浆和肝脏中均受到协同调节，包括 C7、LGALS3BP、TGFBI、ALDOB、CLEC3B、FBLN1、ATRN 和 SERPINF1。独立队列中进行模型性能的验证在独立的ALD验证队列（n=63）中，纤维化阶段2（F2）和轻度炎症阶段2（I2）的蛋白质组学模型产生的ROC-AUC值高于队列中可用的10个同类比较指标中的任何一个，ROC-AUC分别为0.87和0.81。一个独立的验证队列再现了诊断模型的性能，为基于质谱的常规肝病检测奠定了基础。小结研究团队尝试是否可以通过最先进的、基于质谱的蛋白质组学检测方法来检测肝脏相关疾病，研究结果充分表明，蛋白质组检测可以很好的探索和发现肝脏三个关键病理特征的生物标志物组，与综合收集的现有同类最佳临床试验相比，其表现要好得多。并且该研究结果对潜在ALD治疗方案的开发也有启示。例如，20%的上调组织蛋白与受体酪氨酸激酶等信号转导途径有关，虽然研究的比较少但也有药物作用的ALD信号通路，包括G蛋白偶联受体。总之，本研究证实了先前的发现，并提供了对ALD具有诊断、预后和治疗价值的潜在蛋白质靶点。

近日，美国东弗吉尼亚医学院癌症研究中心Lifang Yang团队提出了一种优化的结合了THP聚合物还原和碱性洗涤的差速超速离心方法，以改善EV的分离，并去除THP和其他常见的蛋白质污染物。在应用于尿液中表达的前列腺分泌物时，实现了已知前列腺癌和前列腺癌相关EV蛋白的相对富集。该方法为尿液细胞外囊泡的蛋白质组学分析提供了一个非常有潜力的策略。研究背景对来自患者样本的细胞外囊泡（EVs）的分离提取和随后的分子分析，是了解囊泡生物学并促进生物标志物的开发而广泛使用的策略。尿液中表达的前列腺分泌物是一种肿瘤近端液体，作为潜在的前列腺癌（PCa）生物标志物的来源，在液体活检中得到了极大的关注。对来自PCa患者尿液的前列腺分泌物（EPS-urine）的尿液细胞外囊泡（uEV）的蛋白质分析有望开发非侵入性PCa生物标志物，以改善该疾病的临床管理。然而从尿液中分离EV存在固有的重大挑战，标准的EV分离方法，如差速超速离心法（dUC），回收率较低，并且随EV共同分离得到的蛋白质污染物在典型的质谱（MS）检测中降低了低丰度uEV蛋白的检测深度。因此，研究团队开发了一种改进的dUC方法，使用碱性洗涤方式有效提高回收率，降低蛋白污染物，并将该方法应用于前列腺癌患者尿液样本分析，探讨了前列腺癌相关尿液细胞外囊泡蛋白组学的应用。研究结果先前的研究表明，还原剂可以有效地解聚低速沉淀中的THP基质（Tamm-Horsfall蛋白（THP）），以释放THP包被的EV；然而，THP低聚物/单体和其他丰富的蛋白质可以在随后的高速超速离心（UC）中与EV共沉淀，绕过THP解聚步骤可以避免这些污染物，但随之而来的是部分尿液EV的损失。碳酸钠洗涤剂可以用于分离整体膜蛋白和外周膜蛋白。因此，该研究人员推断，引入碱性碳酸钠洗涤可以通过改变EV及其结合蛋白的可离子化基团的质子化状态来提高EV的纯度，从而减少非共价相互作用。通过比较四种uEV分离方法评估了碱性洗涤步骤的有效性：（1）低速沉淀（20,000g）的DTT处理和高速沉淀的碱性洗涤（175,000g）;（2）低速沉淀的DTT处理和高速沉淀的PBS洗涤;（3）绕过低速沉淀的DTT处理，对高速沉淀采用碱性洗涤;（4）绕过低速沉淀的DTT处理，并采用PBS清洗高速沉淀。这四种方法分别称为 DTT-ALK、DTT-PBS、ALK 和 PBS。dUC方法的原理图多种优化的差速超速离心策略分离uEV的比较与其他方法相比，DTT-ALK制备的uEV中的THP污染显著降低，使 CD9/THP 比率提高了 37–42 倍，TSG101/THP 比率提高了 29–92 倍。所有方法得到的uEV都含有具有特征的圆形囊泡结构。重要的是，在碱性条件下分离的uEV（DTT-ALK和ALK）显示出完整的膜包封囊泡，表明碱性洗涤不会干扰uEV的结构完整性。dUC富集的eps -尿细胞外囊泡的特征所有方法都富集了粒径分布在50和150nm之间的小颗粒，这些颗粒大小在小型EV的预期尺寸范围内；DTT-ALK和PBS方法分离的颗粒的均值和mode尺寸没有显著差异，与DTT-PBS相比，DTT-ALK和PBS的平均和mode颗粒尺寸显著降低；DTT-PBS方法的总体平均颗粒含量最低，DTT-PBS的平均蛋白质/颗粒比（2.46±0.80 SD）明显高于其他方法（DTT-ALK 1.16±0.14 SD; PBS 1.00±0.15 SD），表明这种方法所分离的uEV的纯度最低。总的来说，这些发现表明，DTT-ALK方法具有最佳的uEV分离效率和结构完整性，并且减少了尿液THP污染物。从eps尿液中分离的EV纳米颗粒富集跟踪分析 uEV的蛋白质组学分析为了揭示uEV的蛋白质组成，研究者通过DTT-ALK，DTT-PBS和PBS方法分离的uEV进行了深入的蛋白质组学分析。对uEV P4级分进行无标记的LC-MS/MS定量。在基于DTT-ALK方法的uEV中，鉴定的蛋白质的平均数量最多（1786±9.8 SD），其次是PBS（1598±19.7 SD）和DTT-PBS（1275±2.9 SD）方法。主成分分析表明，由DTT-ALK方法分离的EV更类似于PBS（而不是DTT-PBS）。这些结果强调了每种uEV分离方法的差异蛋白质含量，并表明通过DTT-ALK和PBS分离的uEV表现出相对更大的相似度。不同EV分离方法的LC-MS/MS鉴定蛋白组的比较前列腺癌相关蛋白和组织特异性蛋白的相对富集情况研究人员对比分析了前列腺特异性和前列腺癌相关生物标志物在不同方法之间的相对富集程度，并收集了一份27个PCa生物标志物蛋白的清单，这些蛋白在该研究的数据集中存在，并从文献中证实存在于uEVs中。此外，对照TiGER（组织特异性基因表达和调控）数据库搜索该研究的数据集，寻找 ＂在前列腺中优先表达 ＂的基因转录组，由此产生的列表包括33个推定的PCa生物标志物。结果表明， 27/33个蛋白质的平均强度在三种方法中存在明显差异。分泌蛋白包括前列腺酸性磷酸盐（ACPP/PAP）、激肽释放酶2（KLK2）和前列腺特异性抗原（KLK3 / PSA），在DTT-ALK分离的uEVs中减少，在DTT-PBS方法中富集。相反，DTT-ALK方法显著富集了包括金属还原酶2/4（STEAP2/4）、无糖胺7（ANO7）、谷氨酸羧基肽酶2（FOLH1/PSMA）、视黄醇脱氢酶11（RDH11）、二肽基肽酶4（DPP4）和细胞内蛋白如肽基脯氨酰顺反异构酶FKBP5（FKBP5）、脂肪酸合成酶（FASN）、山梨糖醇脱氢酶（SORD）、蛋白NDRG1（NDRG1）、copine-4（CPNE4）等细胞内蛋白生物标志物。这些结果再一次表明DTT-ALK方法可以富集来自前列腺的uEV。通过独创性通路分析（IPA）来鉴定所有三种方法分离得到的uEV中的PCa相关信号通路，结果表明，使用DTT-ALK方法分离的uEV可以富集前列腺来源和PCa相关蛋白。结论该项研究开发了一种有效的EV分离方法，将DTT处理和碱性洗涤整合到dUC中，以分离出更高纯度、更高产量的uEV。该方法代表了一种易于使用且高效的dUC策略，耗尽大量的尿蛋白以及通过非共价结合作用结合在uEV的蛋白冠，进而提取得到uEV。这样的制备方法可以通过LC-MS/MS对前列腺源性uEV进行全面的深度的蛋白质组学分析。此外，DTT处理和碱性洗涤可以在其他的uEV分离工作流程中应用，进一步提高uEV的纯度。这一方法可以改善尿液临床样本的后续生物标志物发现和开发。参考文献Correll V L, Otto J J, Risi C M, et al. Optimization of small extracellular vesicle isolation from expressed prostatic secretions in urine for in‐depth proteomic analysis[J]. Journal of extracellular vesicles, 2022, 11(2): e12184.

编者荐语：血浆蛋白是各种生物过程的重要“玩家”，参与生长、修复、信号传导、运输和抵御感染。同时，血浆蛋白会随着疾病发生发展过程产生差异化调节。因此，系统而精确地认识正常生理/病理状态下血浆蛋白性质，将能有效推动疾病分子标志物和药物靶标的发现进程。以下文章来源于Human Proteome Organization ，作者HUPO“血浆蛋白的研究早于我们认识到基因的存在 (Proteins in plasma have been studied since before we knew genes existed)。”—— Leigh Anderson & Norman Anderson人类血浆蛋白质组 (The human plasma proteome) 在人类生物学 (Human biology) 和病理生理学 (Pathophysiology) 研究领域起着关键作用，并有望为精准疾病诊断和治疗监测创造一场颠覆性革命。 一方面，血浆蛋白是各种生物过程的重要“玩家”，参与生长、修复、信号传导、运输和抵御感染等关键生命活动。另一方面，血浆蛋白会随着疾病发生发展过程产生差异化调节。因此，系统而精确地认识正常生理/病理状态下血浆蛋白性质，将能有效推动疾病分子标志物和药物靶标的发现进程。困境 ｜“科学幻想”然而人类血浆蛋白组的分析极具挑战性，这种挑战性不仅来源于血浆蛋白本身，亦来源于分析技术、平台的限制。首先，血浆是体液分析中最复杂、最多样化的样本。因为（1）血浆中最高和最低丰度蛋白浓度的差值大于10个数量级。高丰度蛋白，如白蛋白和免疫球蛋白，占总血浆蛋白的80%；而其余蛋白以很低的浓度存在，但它们与许多疾病的演变过程相关，亦是潜在的生物标志物。所以，在进行血浆蛋白质组分析时，去除高丰度蛋白的干扰至关重要；其次，（2）血浆中存在着大量的蛋白质变体 (Proteoform)，如内源性短肽和不同翻译后修饰 (Post-translational modification, PTM)的蛋白，这使其复杂性和分析难度都更上一层楼；此外，（3）年龄、性别和遗传因素所造成的个体区别带来了更高层次的差异性，使分析工作量及研究难度变得更加难以想象。技术瓶颈也是血浆蛋白研究难越关山的关键一环。传统的蛋白质组学分析技术，如二维凝胶技术 (Two-dimensional gels) ，因检测范围有限，无法对血浆蛋白质组进行无偏差、高深度的分析。换句话说，在那个质谱技术还未被广泛应用的时期，研究人员无法更准确地“看”到更多血浆蛋白，这使得血浆蛋白生物标志物的发现一度成为“科学幻想”。除了“看”存在问题以外，血浆蛋白的发现数量与其临床诊断应用之间也存在着沟壑。2002年一篇文章指出，彼时所能检测到的血浆蛋白仅为几百个，而能应用于临床诊断和治疗监测上的则区区几十个，少之又少。▲ 1994年至2002年间，FDA认可批准的血浆蛋白标志物数量呈下降趋势 (来源：The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects)探路者 ｜ HPPP项目的成立为解决以上问题，国际人类蛋白质组组织 (Human Proteome Organization, HUPO) 首任主席Sam Hanash于2002年启动重点试点计划——人类血浆蛋白质组学项目 (Human Plasma Proteome Project, HPPP)。该项目由HUPO创始人之一Gilbert Omenn领头，来自13个国家的35家蛋白质组学实验室参与其中。▲ Gilbert Omenn（左）和 Sam Hanash（右）HPPP项目为人类蛋白质组研究的“先行者”之一，因为HPPP是HUPO早期推动项目之一，更因为血浆蛋白无可替代的研究价值。首先，（1）血浆蛋白质组是人类蛋白质组中最复杂的一个类别，囊括了不同组织的亚蛋白质组；（2）血浆是主要的临床样本。与其他体液（如脑脊液、胃液、胆汁和滑膜液）相比，血浆也更容易获得及标准化；（3）血浆蛋白对疾病诊断和疗效监测具有重要意义。因为血浆蛋白会随着血液循环流经全身，因此可反映多种疾病问题。血浆亦成为发现临床诊断监测和判断药物反应蛋白生物标志物的潜在丰富来源。目前已有一些血浆及血清蛋白被确定为疾病的潜在生物标志物，包括心血管疾病、自身免疫性疾病、感染性疾病和神经系统疾病；（4）血浆蛋白与其相应的mRNA表达相关性不大，因此以蛋白质水平对其展开研究以作补充。 与此同时，基于上文所提到的血浆蛋白自身的复杂性，以及分离、分析技术和平台的多样性，HPPP项目确定了其初期研究目标：（1）比较蛋白质组分析技术平台的优点和局限性，如灵敏度和分析深度；（2）分析人类血浆/血清参考样本 (Reference specimens)；（3）建立人类血浆蛋白质组知识库。进程｜质谱之下的人类血浆蛋白而其实早在HPPP项目开展前，就已经有科学家去啃血浆蛋白质组这块“硬骨头”了。20世纪70年代，随着彼时高分辨率二维凝胶电泳技术 (Two-dimensional Electrophoresis) 的引入，血浆蛋白的检测变得可行。1977年，Leigh Anderson （血浆蛋白质组研究所创始人）和 Norman Anderson（血浆蛋白质组研究所高级科学顾问）两位研究人员成功鉴定出49种血浆蛋白质。▲ Leigh Anderson 和 Norman Anderson 利用二维凝胶电泳技术成功鉴定出49种血浆蛋白质2002年，Leigh和Norman再接再厉，从文献中整理出289种血浆蛋白并进行汇编，这也是第一个大型血浆蛋白汇编。同年，Joshua Adkins（西北太平洋国家实验室生物科学部副主任）利用在线反相微毛细管液相色谱与离子阱质谱联用技术 (On-line reversed-phase microcapillary liquid chromatography coupled with ion trap mass spectrometry) 对血清中的蛋白质进行分析，并成功鉴定出490种血浆蛋白质。▲ Leigh Anderson 和 Norman Anderson 整理289种蛋白质（左）；Joshua Adkins利用在线反相微毛细管液相色谱与离子阱质谱联用技术鉴定出490种血浆蛋白质（右）随着质谱技术的进步与广泛应用，血浆蛋白组相关数据迅速涌现，但数据之间的可比性存在着较大问题。2003年，HPPP获得一批来自世界主要人种的样本：白种美国人(Caucasian-American)、非裔美国人(African-American)，和亚裔美国人(Asian-American)，并将它们制备成混合血浆和血清。与HPPP合作的35个实验室都得到了这批样本，但他们所应用技术平台和数据提取、分析方法各不相同，这导致数据结果间出现了很大差异。项目报告指出，该研究共检测出9504个不重复蛋白，每个实验室都能检测到这9504个蛋白质中的至少1个肽段。其中的3020个蛋白质能被检测出至少两个肽段，而能被检测出3个肽段的蛋白质数量为1500。由于数据间的可比性较差，研究人员于2006年对这份报告进行再分析，认为仅有889个蛋白质拥有高可靠性证据证实其存在。逐渐地，质谱技术向双“高”发展（高灵敏度和高准确度），蛋白质的量化鉴定规模也“水涨船高”。与早期血浆蛋白质组数据库相比，现在的二级质谱图具有高分辨率的特性，使样品分析的准确度大为提高，假阳性率大大降低。研究人员因此能够“看”得更“深”、更“多”——观察到更多的肽段，并提高了序列覆盖率。 2005年，Eric  Deutsch（Moritz实验室首席科学家）与8个实验室应用液相色谱-串联质谱法对血浆/血清进行研究，并将实验结果映射到Ensembl人类基因组数据库 (Ensembl Genomes) 中。数据显示，共有6929个肽段被映射到960个蛋白质中。2011年，Terry Farrah（曾任职于系统生物学研究所）研究团队识别了1929个高可靠性蛋白质 (FDR为1%)；2013年，共有3553个不重复蛋白质被成功鉴定。 2015年，Hasmik Keshishian团队 (麻省理工Broad Institute蛋白质组学研究中心高级科学家) 以四位进行过心肌梗塞手术的肥厚型心肌病 (Hypertrophic cardiomyopathy, HCM) 患者的血浆为样本，应用iTRAQ技术和高分辨率的Q Exactive Plus Orbitrap仪器进行分析。他们成功将每个样品中的至少3400个蛋白质进行量化，部分样品中有5300个蛋白质被成功鉴定（FDR